Vršeći redovne preglede proizvodnih zasada jabučastog voća konstatuju se simptomi nalik promenama koje prouzrokuje bakterija Erwinia amylovora (Burrill 1882) Winslow et al.1920. Kako okularna dijagnoza na terenu nije pouzdana moraju se izvršiti i laboratorijsko-bakteriološki testovi radi identifikacije pravog uzročnika bolesti (Arsenijević et al.,1994a). Jer, opšte je poznato da jedan patogen može prouzrokovati različite simptome bolesti i obrnuto: naoko slične ili čak iste promene ispoljene na obolelim biljkama mogu biti rezultat dejstva raznih agenasa biotske i abiotske prirode. Otuda tačna dijagnoza bolesti i pouzdana identifikacija patogena od strane specijalista –fitopatologa ima svoje puno opravdanje.

Imajući u vidu značaj i potrebu bržeg uvida u prisustvo E.amylovora na terenu radi preduzimanja odgovarajućih mera, nastojali smo da priručnim laboratorijama kakve postoje u strućnim službama, proverimo neke već poznate, a u ovom radu i modifikovane, postupke dokazivanja prisustva ovog patogena. Svi testovi primenjeni su u uslovima priručne laboratorije, koja ne poseduje kompletnu laboratorijsku opremu i tehniku, a sve u cilju verodostojnijeg dokazivanja prisustva patogena, umesto vizuelnog.

Postupak i rezultati

Korišćen je inficirani biljni materijal (grane, lišće, peteljke lista, plod i drugi oboleli delovi) prikupljeni sa obolelih višegodišnjih stabala jabučastog voća: jabuke, kruške, dunje i mušmule. Primenjena tehnika rada za dokazivanje prisustva bakterije E.amylovora sadrži sledeće postupke:

1.Inokulacija nesazrelih plodića šljive, zbog brzog formiranja karakterističnih kapljica bakterijskog eksudata (Arsenijević et al., 1994 a,b)

2.Ponašanje bakterija prema Gramu (Arsenijević, Jovanović Olivera,1995);

3.Serološki test aglutinacije na mikroskopskim pločicama (Arsenijević et al., 1994c).Sl.1. Tipični simptomi E.amylovora - povijanje vrha mladara jabuke  u vidu  "pastirskog štapa" i pojava kapljica bakterijskog eksudata na obolelim plodovima jabuke.

1.Prilikom inokulacije nesazrelih plodića šljive sorte Stanley korišćeno je više metoda, kako bi se utvrdilo koji je najefikasniji i koji od metoda za kraći vremenski period omogućuje pojavu bakterijskog eksudata na inokulisanim plodićima. Kao najznačajniji pokazali su se sledeći postupci:

-Ubod u tkivo plodića pomoću igle. Upotrebljeni su nesazreli plodići šljive, sorte Stanley i suspenzija bakterije pripremljena sledećim postupkom: sa prelaza obolelog i zdravog tkiva inficiranog uzorka, nakon odstranjivanja pokoričnog tkiva, skalpelom se odseca manji delić i prenosi u sterilne avane u kojima je prethodno nalivena manja količina sterilne ili destilovane vode.Odsečeni deliči nekrotičnog tkiva treba da odstoje u avanu oko desetak minuta. Nakon toga vrši se gnječenje biljnog tkiva sterilnim tučkom. Ovako dobijena suspenzija bakterija nanosi se ubodom na plodove šljive pomoću igle, obično na tri mesta, rasporedjena u vidu trougla. Inokulisani plodići postavljaju se u vlažnu komoru i navlaže prskanjem manjom, ručnom prskalicom, a potom prekriju polivinilom. Kao vlažne komore pogoduju i plastične kadice, laboratorijsko stakleno zvono obloženo filter papirom ili neke druge odgovarajuće posude.

-Metod „bazenčića“. Korišćenjem ovog postupka na plodiću šljive skalpelom se, zasecanjem i odstranjivanjem isečenog tkiva, priprema manji otvor na plodu u vidu „bazenčića“. U „bazenčić“ se potom postavljaju manji fragmenti inficiranog tkiva uzetog s prelaza obolelog i zdravog dela: grane, peteljke lista, lista ili s nekog drugog organa obolele voćke. Plodovi se, kao u prethodnom slučaju postavljaju u vlažne kadice ili pod stakleno zvono, a prethodno navlaže prskanjem.

-Metod „kočića“ ili „isečka“.Prilikom primene ovog postupka koriste se klinasto izduženi delići biljnog tkiva uzeti s prelaza obolelog i zdravog tkiva i od njega prave manji „koćići“ („isečci“). Oni se ubodom postavljaju u tkivo plodića, na tri mesta, na koji su prethodno iglom izvršene povrede u vidu manjih udubljenja. Obezbedjenje vlažnosti vrši se prskanjem plodića običnom vodom pomoću ručne prskalice.

-Inokulacija zemljišnom suspenzijom. Ispod krune oko korena obolelih voćaka, jače inficiranih bakterijom E.amylovora, odstrani se površinski deo zemljišta i uzme reprezentativni uzorak. Uzeti uzorak se potom potapa u srazmernu količinu vode i ostavi da odstoji oko tridesetak minuta. Nakon toga, dobijena suspenzija se kroz gazu, više puta profiltrira, kako bi se sva nečistoća odstranila. Istovremeno se mladi, još nesazreli plodići šljive blago povrede čiodom na više mesta, a potom unose u već pripremljenu suspenziju zemljišta (Van der Zwet ibeil,1979 i Panić i Arsenijević, 1996). Tu se ostave da odstoje petnaestak minuta, a potom prenose u vlažnu komoru, gde ostaju 3-7 dana pri uslovima sobne temperature.

Kako se tokom ovih eksperimenata pokazalo, sva napred navedena četiri postupka, primenjena pri inokulaciji neszrelih plodića šljive, sorte Stanley, daju pozitivan rezultat. Tako se prve promene na plodićima ispoljene u vidu mrkih nekrotičnih prstenova pojavljuju već nakon 24-48 sati od inokulacije. Gotovo istovremeno, ili nešto kasnije, uočavaju se sitne, fine kapi bakterijskog eksudata, formirane oko mesta gde je izvršena inokulacija ili nešto dalje po površini plodića.

Narednih dana pojava eksudata je sve izraženija. Eksudat je u početku bele do krem boje, a nakon nekoliko dana postaje tamniji. Tokom sedam dana inokulisani plodić potpuno nekrotira i pocrni. Umesto šljive u ovu svrhu mogu se koristiti i nesazreli plodići drugih voćaka: kruške, trešnje, višnje. Metod inokulacije plodova ubodom pomoću igle, uz korišćenje suspenzije bakterija dobijene gnječenjem nekrotičnog tkiva u avanu, pokazao se najefikasniji. Jer, pojava kapljica eksudata nastaje brzo, već posle 2-3 dana od inokulacije, a kod inokulacije zemljišnom suspenzijom nešto kasnije.

2.Pri testiranju ponašanja bakterija prema Gramu primenjen je postupak kod nas već proveren.Na mikroskopsku pločicu postavlja se kap 3 % KOH, a zatim pomoću čačkalice za zube uzima bakterijski eksudat formiran na plodu inokulisanom fragmentom nekrotičnog tkiva i obe kapi čačkalicom dobro izmešaju. Podizanjem čačkalice 1-2 cm uvis pojavljuje se kontinuirana nit, odnosno „končić“, što predstavlja znak gramnegativnog ponašanja bakterija uopšte, a u našem slučaju vrste E.amylovora.

3.Za serološki test aglutinacije na mikroskopksim pločicama korišćen je antiserum bakterije E.amylovora, proizveden u našoj zemlji pomoću autentičnog soja bakterije E.amylovora 1430 (poreklom iz Francuske), koji se čuva u kolekciji Poljoprivrednog fakulteta u Novom Sadu (Arsenijević, M.). Test je primenjen uobičajenim postupkom: Iz bočice pomoću medicinskog šprica uzima se antiserum bakterije; Kap uzetog antiseruma se postavlja na mikroskopsku pločicu; Onda se čačkalicom za zube, uzme manja količina bakterijskog eksudata (od kapi sa plodića inokulisanog obolelim tkivom) i nanosi na mikroskopsku pločicu pored kapi antiseruma. Zatim se obe ove kapi zajedno homogenizuju istovremenim mešanjem pomoću bakteriološke petlje. Pojava sitnih, peskovitih čestica ispoljenih u vidu zgrušavanja, odnosno stvaranja pahuljastog taloga, znak je aglutinacije, tj. prisustva E.amlyovora, što se u našem slućaju i potvrdilo.

Zaključak

Pouzdano dokazivanje prisustva patogena E.amylovora korišćenjem odgovarajućih, opšte poznatih testova, otežan je ali praktično izvodljiv postupak i u manjim improvizovanim laboratorijama formiranim u stručnim službama, agrozavodima ili na poljoprivrednim gazdinstvima, gde na terenu postoje stručna lica – specijalisti za zaštitu bilja.

U tu svrhu, inokulacija nesazrelih plodića šljive sorte Stanley (kao i nesazrelih plodića drugih voćaka: kruške, višnje i trešnje), ponašanje bakterija prema Gramu, uz upotrebu 3 % KOH i primena aglutinacionog testa na mikroskopskim pločicama sa serumom bakterije E.amylovora, pouzdani su i preporučljivi testovi. Kao takvi sa sigurnošću se mogu koristiti za brzu identifikaciju E.amylovora i na terenu, u uslovima priručne laboratorije koja ne poseduje kompletnu laboratorijsku opremu i tehniku za identifikaciju ovog karantinskog patogena.

Pozitivna strana ovog pokušaja je i ta što se prve analize mogu izvršiti i rezultati dobiti za vrlo kratko vreme, već posle 2-3 dana. Dakle, ne gubi se mnogo vremena. U suprotnom slućaju to traje mnogo duže kada se oboleli uzorci šalju naučnim ustanovama, koje su službeno registrovane za identifikaciju E.amylovora, radi pouzdanog utvrdjivanja prisustva parazita od strane fitobakteriologa. Ovaj postupak je od posebnog značaja prilikom vršenja pregleda zdravstvenog stanja sadnica u rasadnicima i matičnih stabala.

Literatura

Arsenijević, A., Trkulja,V.,Jovanović Gordana i Todorović, D. (1994a). Simptomi bakterioznoj plamenjači voćaka nalik i mogućnosti pouzdane i brze identifikacije patoegan erwinia amylovora. III Jugoslovenski kongres o zaštiti bilja,3-7.10.1994., Vrnjačka Banja, Zbornik rezimea, 40.

Arsenijević, M., Trkulja, V., Špica Gorica i Keserović, Z. (1994b): Pogodnost nesazrelih plodova raznih  vrsta i sorti voćaka kao testa patogenosti bakterije Erwinia a,ylovora (Burrill) Winslow et al. III Jugoslovenski kongres o zaštiti bilja, 3-7.10.1994., Vrnjačka Banja, Zbornik rezimea, 40.

Arsenijević,M., Đurišić,S. i Mitrev,S. (1994c): Serološko identifikovanje izoalata bakterije Erwinia amylovora parazita jabučastih voćaka. Zaštita bilja 210,273-278, Beograd.

Arsenijević,M. i Jovanović Olivera (1995): Serološka identifikacija izolata bakterije Erwinia amylovora parazita jabučastih voćaka. Zaštita bilja 211,57-62, Beograd.

Panić,M. i Arsenijević,M. (1996): Bakteriozna plamenjača jabučastih voćaka i ukrasnih biljaka – Erwinia amylovora. – „Zajednica za voće i povrće“ DD Beograd i Poljoprivredni fakultet, Novi Sad.

Van der Zwet,T., Keil,H.I. (1979): Fire blight. A bacterial Disease of Pomaceous Plants. U.S. Goverment Printing Office, Washington,D.O.,J-200.